Jesse Gordon Spencer wurde am 12. Februar 1979 in Melbourne, Australien geboren. Schon früh hat er Schauspielerfahrung am Theater gesammelt (u.a. als Peter Pan, Christopher Robin in „Winnie the Pooh“ und Jack in „Jack and the Beanstalk“).

In der australischen Soap "Nachbarn" ("Neighbours") spielte er von 1994 bis 2005 die Rolle des "Bill Kennedy". In Deutschland gelang ihm der Durchbruch durch seine Hauptrolle in der Ärzte-Drama-Serie "Dr. House“. Von 2004 bis 2012 spielte er dort in der Stammbesetzung "Dr. Robert Chase".

Außerdem wirkte Spencer in dem Kinofilm "Uptown Girls – Eine Zicke kommt selten allein", sowie dem Fernsehfilm "Stranded" mit. In "Gegen den Strom" übernahm er 2003, an der Seite von Judy Davis und Geoffrey Rush die Rolle des australischen Schwimmidols Tony Fingleton. Für seine Rolle in "Nachbarn" war Spencer 1998 und ’99 für den "Beliebtesten Darsteller" bei den "Logie Awards" nominiert. Bei den "Teen Choice Awards" wurde er 2005 für "Dr. House" in der Kategorie "Choice TV Breakout Performance – Male" nominiert, sowie 2009 für die Screen Actors Guild Awards. 2006 bekam er die Auszeichnung "Golden Boomerang" bei den australischen "Breakthrough Awards".

Seit 2014 war er darüber hinaus in seiner Rolle aus "Chicago Fire" in einigen Gastrollen im Serien-Spin-off "Chicago P.D." zu sehen. Das "People Magazine" zählte ihn 2007 außerdem zu den 100 attraktivsten Menschen der Welt.